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農業農村部農業主推技術:多種對蝦病毒的現場快速高靈敏檢測技術

2019-11-08 09:41:00  水產養殖網  出處:農業農村部        瀏覽量: 16257 次 我要評論
技術概述:
我國養殖蝦類產量在2008年達到198萬噸,占世界總產量的40%以上,對蝦病毒病爆發給我國對蝦養殖業造成損失在50億元以上;開展對蝦苗種病毒檢測是避免病毒病大規模爆發流行減少損失的重要途徑。
環介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技術是2000年由Notomi 等發明的一種全新的等溫擴增技術。通過開展LAMP技術檢測對蝦病毒的研究,中國水產科學研究院黃海水產研究所成功開發出實用性強、特異性高的對蝦白斑綜合征病毒(WSSV)、桃拉綜合征病毒(TSV)、傳染性皮下及造血組織壞死病毒(IHHNV)、肝胰腺細小病毒(HPV)、斑節對蝦桿狀病毒(MBV)、黃頭病毒(YHV)、傳染性肌肉壞死病毒(IMNV)、羅氏沼蝦諾達病毒(MrNV)、凡納濱對蝦諾達病毒(PvNV)、對蝦桿狀病毒(BP)等十多種蝦類病毒的系列核酸等溫擴增檢測技術;同時,通過研發核酸快速制備、染料固定化等配套技術,目前已經建立了上述病毒的現場快速高靈敏檢測技術并研發生產了相關檢測試劑盒。
此技術具有如下優點:
(1)靈敏度高,對病毒的檢測可低至10個拷貝,其靈敏度比普通PCR方法高100倍以上;
(2)特異性強,所用的檢測引物均是依據病毒保守基因中6個不同區域設計,特異性超過常規PCR;
(3)檢測時間短,從核酸制備到檢測完成只需1個小時;
(4)儀器要求寬松,不需要復雜的儀器設備,只要一個水浴鍋或金屬浴,甚至一暖壺開水和一個溫度計就能完成檢測反應。
(5)操作簡單、結果明顯。整個檢測過程不涉及復雜儀器或設備,稍具分子生物學基礎的人員即可完成操作;檢測結果清晰明顯,直接用眼睛觀察就可以判斷。     
(6)對人和環境安全。檢測過程中不使用有毒試劑,對人和環境都非常安全。
(7)低成本。 LAMP檢測總成本大大低于現有最廉價的PCR檢測方法。
目前,該項技術已申請國家發明專利20項,獲得授權14項。
增產增效情況:目前,利用上述檢測技術已經完成了對來自遼寧、天津、河北、山東、江蘇、浙江、福建、廣東、廣西等省市的800多份對蝦樣品的檢測。檢測結果顯示,核酸等溫擴增檢測方法比PCR檢測方法具有更高的靈敏度和可靠性。并且,該檢測技術不涉及有毒的試劑,對操作人員健康和環境保護都非常友好;與之前對蝦病毒檢測技術相比,該項技術除對儀器設備無特殊要求外,還能使檢測成本降低50%以上。
技術要點:
1.取對蝦個體(仔蝦、幼體和幼蝦)或對蝦鰓絲或附肢(成蝦)樣品約磨碎至漿狀;
2.用牙簽蘸取漿狀的樣品分別采樣用膜片充分潤濕;
3.用吸管吸取A液,滴于的采樣用膜片上;
4.取新牙簽將上述采樣用膜片漂洗3~4 分鐘;
5.采樣用膜片、陽性及陰性對照膜片于95℃保溫4 分鐘,迅速置于冷水中2分鐘;
6.將上述膜片轉入反應液中57~60 ºC保溫50分鐘;
7.將反應液于90~95 ºC保溫2分鐘;
8.觀察反應液顏色,如果顯示綠色則表示該樣品的病毒檢測結果為陽性,如果顯示橙黃色則表示該樣品的病毒檢測結果為陰性。
適宜區域:適于在現場、水產養殖企業、相關各級實驗室使用,尤其能夠滿足技術力量相對薄弱的對蝦育苗、養殖單位開展現場檢測的需要。
注意事項:
1.因該檢測技術的靈敏度非常高,所以檢測過程應嚴格按照操作指南進行,反應結束后不能打開擴增檢測管,以防反應產物濺出污染后續檢測樣品導致假陽性的出現。
2.黑色背景更利于實驗結果的觀察。擴增反應結束后,可利用試劑盒說明書中提供的黑色背景進行觀察。
技術依托單位:中國水產科學研究院黃海水產研究所(出處:農業農村部)
投稿信箱:[email protected]
發布人:汪楊
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